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線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ檢測(cè)試劑盒使用方法

產(chǎn)品說明：線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q還原酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD還原為FADH2，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q 生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm有特征吸收峰，通過檢測(cè)2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、丙酮、冰和蒸餾水。 

注意事項(xiàng)： 

1、 為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測(cè)定的吸光值過高（高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測(cè)定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣本體積來提高靈敏度。

2、 樣本蛋白濃度需自行測(cè)定。由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。

3、 推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本質(zhì)量計(jì)算，則需加測(cè)胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。 4、 本試劑盒試劑足夠完成25管反應(yīng)。

 5、 附:使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測(cè)數(shù)為 25T/12S） A、上清中復(fù)合體II活力的計(jì)算: 單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。復(fù)合體II活性（U/g 質(zhì)量）=[ΔA1×V反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣本)）÷T=476.2×ΔA1÷W ΔA1：上清測(cè)定值；V反總：反應(yīng)體系總體積，10-3L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V提取：加入提取液體積，1mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；W：樣本重量，g；109：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。