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細胞培養(yǎng)的環(huán)境及條件有哪些？

細胞凍存方法、步驟及注意事項！

一、保存方法（主要有兩個）：

（1）傳統(tǒng)方法：冷存管置于410分鐘→ -2030分鐘→ -8016～18小時（或隔夜）→液氮槽vaporphase儲存。-20不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

（2）程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3/分鐘之速度由室溫降至（-80以下）-120，再放在液氮槽vaporphase儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。

二、步驟：

（1）冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細胞生長情形。

（2）配制冷凍保存溶液（使用前配制）：將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中，*后濃度為5～10％，混合均勻，置于室溫下待用。

（3）依細胞繼代培養(yǎng)之操作，收集培養(yǎng)之細胞，取少量細胞懸浮液（約0.1ml）計數細胞濃度及凍前存活率。

（4）離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106cells/ml，混合均勻，分裝于已標示*之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。

三、注意事項：

（1）欲冷凍保存之細胞應在生長良好（logphase）且存活率高之狀態(tài)，約為80–90％致密度。細胞凍存前應細胞的活力好，無污染

（2）冷凍前檢測細胞是否仍保有其*性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。

（3）一定要DMSO的濃度是10%，凍細胞要舍得用的DMSO

（4）注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色（以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接無菌產品，如Sigma D-2650），以5～10ml小體積分裝，4避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽**后避光保存。在開啟后一年內使用，因儲存后對細胞會有毒性。

（5）慢凍,快解凍。細胞在 -15 度左右胞內形成結晶對細胞損傷，緩慢降溫有助于減少損傷，故放入 -20 度冰箱中凍存可實現緩慢降溫較為方便，保存時間過久會影響細胞活力。

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