DAPI染色原理及使用說(shuō)明
DAPI 是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料。它結(jié)合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對(duì)處，一個(gè)DAPI分子可以占據(jù)三個(gè)堿基對(duì)的位置。結(jié)合到雙鏈DNA上DAPI分子的熒光強(qiáng)度提高大約20倍，常用與熒光顯微鏡觀測(cè)，根據(jù)熒光的強(qiáng)度可以確定DNA的量。另外，因?yàn)?/span>DAPI可以透過(guò)細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長(zhǎng)的光線激發(fā)。單獨(dú)DAPI的大吸收波長(zhǎng)為340nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為488nm；當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)，大吸收波長(zhǎng)為364nm，大發(fā)射波長(zhǎng)為454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可以和RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度只有與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度的1/5，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍約在500nm左右。
使用說(shuō)明（僅供參考）
1. 配制工作液：用雙蒸水或PBS稀釋母液，配制成所需要的工作的濃度（0.5-10 μg/mL），工作液可于4 ℃保存6個(gè)月。
2. 固定的細(xì)胞或組織染色：對(duì)于固定的細(xì)胞或組織樣品，固定后，適當(dāng)洗滌去除固定劑。DAPI染色通常在其他染色的后進(jìn)行。如果不需要進(jìn)行其它染色，則直接進(jìn)行DAPI 染色。
a）對(duì)于貼壁細(xì)胞或組織切片：加入適量DAPI染色液，覆蓋住樣品即可。
對(duì)于懸浮細(xì)胞：至少加入待測(cè)染色樣品體積3倍的染色液，混勻。室溫放置3-5分鐘。
b）吸除DAPI染色液，用TBST、PBS或生理鹽水洗滌2-3次，每次3-5分鐘。
c）直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。
3. 活細(xì)胞或組織染色：
a）細(xì)胞培養(yǎng)物中加入適量DAPI染色液，約1/10細(xì)胞培養(yǎng)基體積，必須充分覆蓋住待染色的樣品。通常對(duì)于六孔板一個(gè)孔需加入1 mL染色液，對(duì)于96孔板一個(gè)孔需加入100 μL染色液。
b）在 37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞 10～20 分鐘。
c）用 PBS或合適的緩沖液洗細(xì)胞兩次。
d）直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。
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